Для выбора правильного метода лечения инфекционных заболеваний необходимо установить тип возбудителя. Стандартные мазки и бактериологическое исследование не всегда позволяют выявить инфекцию, а вирусы невозможно получить на питательных средах. Поэтому в гинекологии, в частности, используют ПЦР-анализ, который эффективен на этапе диагностики патологии и контроля лечения.
Полимеразная цепная реакция – это метод молекулярной биохимии, который разработал в 1983 г. американский ученый К. Мюллис. Но его основы заложили еще в 1970 годах норвежские ученые, которые разработали способ построения копий молекул ДНК. Американский ученый доработал метод, что позволило воспроизводить исходную молекулу любого генетического материала при помощи обработки специальным ферментом ДНК-полимеразой. Методика сделала переворот в молекулярной биохимии, а в 1996 году К. Мюллису за изобретение присудили Нобелевскую премию.
Особенности исследования
ПЦР-диагностика отличается от других методов исследования. В искусственных условиях производится копирование небольшого участка нуклеиновой кислоты. Реакция запускается только в случае, если в исследуемом образце есть компонент ДНК, который соответствует заданным условиям.
Создание копии нуклеиновых кислот похоже на аналогичный процесс в живом организме, но в клетках создается полный образец, а ПЦР запускает синтез небольшого короткого сегмента. Длина копируемых оснований в ходе исследования составляет не больше 3000 пар, тогда как у человека – больше 3 млрд пар.
В медицинской практике используются разные типы исследований. Изначально анализ ПЦР на ИППП позволял определить только присутствие патогенных микроорганизмов. В настоящее время разработан количественный анализ ПЦР, или в режиме реального времени, который выявляет изменение присутствия генетического материала в образце. Поэтому в результате отражается число колониеобразующих единиц бактерий или количество вирусов.
Полимеразная цепная реакция в гинекологии применяется для поиска следующих микроорганизмов:
- хламидии;
- уреаплазмы;
- микоплазмы гоминис и гениталиум;
- трихомонады;
- гонококки;
- цитомегаловирус;
- герпес 1 и 2 типа;
- ВПЧ;
- гарднереллы;
- кандиды.
Достоинства и недостатки методики
Полимеразная цепная реакция значительно упрощает диагностику инфекционных заболеваний, которые встречаются у гинекологических больных. К достоинствам исследования относится его высокая чувствительность. Некоторые заболевания могут иметь скрытый характер, не выявляются при помощи мазка и бактериологии, но протекают с периодическими клиническими проявлениями. Для получения положительного результата достаточно, чтобы в исследуемом материале присутствовало всего несколько фрагментов нуклеиновой кислоты. Высокая чувствительность позволяет выявить вирусные заболевания через короткое время после инфицирования, когда клинические симптомы еще отсутствуют.
Среди других положительных аспектов выделяют следующее:
- для исследования подойдет любой биологический материал;
- комплексность – после взятия одной пробы можно провести обследование на множество микроорганизмов;
- высокая скорость – для получения копии генетического материала достаточно 5-7 часов, поэтому результат исследования выдается на руки в течение суток;
- высокая точность позволяет избежать ложноположительных или ложноотрицательных реакций, которые часто возникают при иммунологическом исследовании из-за перекрестных реакций;
- низкая стоимость реагентов делает исследование доступным для большинства лабораторий и пациентов.
К недостаткам комплексного анализа ПЦР относят высокие требования к получению биологического материала. Образцы должны быть взяты стерильными инструментами, на которых не будет присутствия внешнего загрязнения или других клеток. В помещении, где производят забор анализа, должны быть установлены качественные фильтры, которые очищают воздух на 99,9% от микробов, вирусов и фрагментов ДНК. Иначе результат может быть непредсказуемым.
Какой материал используют для диагностики
Для обследования на половые инфекции у женщин чаще всего берут мазок из заднего свода влагалища или уретры. Если взять отделяемое из преддверия влагалища, исследование может быть неверным. Большая часть микроорганизмов поселяется в глубине складок слизистой оболочки. На вульве вагинальная микрофлора может смешиваться с микроорганизмами с кожи, а у пациенток, активно использующих гигиенические ежедневные прокладки или носящих трусики-стринги, может присутствовать флора из прямой кишки.
Для исследования реже применяется моча. Диагностика вирусных инфекций проводится по образцу крови.
У женщин, родивших детей с признаками внутриутробной инфекции, после выкидыша, для диагностики может использоваться участок плаценты, материал абортуса.
Показания для обследования
Мазок на ПЦР назначают по определенным показаниям:
- Определения состава возбудителей при имеющихся клинических проявлениях острой инфекции.
- Хроническое воспаление половых органов с периодами обострений.
- Контроль проведенного лечения.
Точность диагностики в комплексном анализе помогает выявить полный спектр возбудителей и подобрать лекарственные препараты. Некоторые микроорганизмы чувствительны к узкому спектру антибиотиков. Например, трихомонады можно вылечить только Метронидазолом. Если его не назначить в составе комбинированной схемы, инфекция перейдет в хроническую форму. Но и превентивное назначение антибиотика плохо влияет на собственную микрофлору, увеличивает риски появления побочных реакций.
ПЦР-диагностика назначается женщинам с эрозией или эктопией шейки матки. Воспалительный процесс экзоцервикса часто связан с инфицированием вирусом папилломы человека. ВПЧ 16, 18, 33 типа относится к высокому онкогенному риску и способен вызвать атипическую трансформацию клеток, которая становится дисплазией и переходит в рак шейки матки. Поэтому необходимо проводить обследование, во время которого определяется тип возбудителя, чтобы строить прогнозы и подбирать лечение.
При постановке на учет по беременности анализ проводится для поиска инфекции, которая может повлиять на вынашивание плода. Обследование назначают при положительных иммунологических тестах, в которых выявляются иммуноглобулины, свидетельствующие о присутствии возбудителя. Воспроизводство копий ДНК уточняет присутствие возбудителя вне зависимости от реакции организма на него.
Беременным необходимо обследование на цитомегаловирус. Первичное инфицирование в период вынашивания ребенка приводит к невынашиванию и тяжелым порокам развития (о том, чем опасен цитомегаловирус во время беременности, мы уже рассказывали).
Подготовка пациентки
Для получения точного результата необходима правильная подготовка к сдаче анализа, которая зависит от типа исследуемого материала.
Кровь для анализа берут из вены строго натощак. Последний прием пищи должен быть вечером, оптимальный промежуток до забора материала должно пройти не менее 8 часов. Плохо влияют на состав крови жирная и острая пища, алкоголь, некоторые лекарственные препараты.
Моча сдается рано утром. Необходимо собрать ее до проведения гигиенических процедур в стерильную тару. В случае сомнительного качества собранной мочи, ее можно собрать при помощи уретрального катетера напрямую из мочевого пузыря.
Для исследования мазка из уретры или влагалища методом ПЦР, необходимо воздержаться от секса в течение нескольких дней. Запрещено проводить спринцевания и другие вмешательства, во время которых произойдет изменение состава флоры. Результат может оказаться неточным. Перед взятием материала нельзя мочиться 2 часа, чтобы не вымыть микроорганизмы струей мочи. Женщинам не берут анализы во время менструации и в течение 2 дней после ее окончания.
Как выполняется ПЦР
То, как берут мазок, мало отличается от обычного забора отделяемого из влагалища. Процедура выполняется на гинекологическом кресле. Диагностика проводится в ближайшее время, но исследуемый материал может сохраняться долгое время.
Сама реакция состоит из нескольких этапов. Ее проводят в специальном приборе – амплификаторе. В нем происходят циклы нагревания и охлаждения с высокой точностью температуры. Чтобы биологический материал не испарялся, к смеси добавляют вазелиновое масло.
Для проведения полимеразной цепной реакции используют следующие компоненты:
- ДНК-матрица, которая содержит участок нуклеиновой кислоты, требующий воспроизведения;
- два праймера – коротких участка нутклеотда, которые нужны для воспроизводства матричной цепочки;
- термостабильный фермент ДНК-полимераза;
- нуклеозидфосфаты;
- магний в состоянии ионов;
- буферный раствор, который обеспечивает необходимую кислотность среды, содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
Все исследование проходит в три стадии. Сначала выполняется денатурация. Матрицу ДНК нагревают до 98°С, чтобы ее две цепочки разошлись. Для разогрева достаточно от 30 секунд до 2 минут. Во время денатурации происходит разрушение водородных связей в молекуле, она теряет структуру двойной спирали. В некоторых случаях проводится и предварительный разогрев праймеров. Этот тип исследования называют горячим стартом, он помогает снизить количество побочных продуктов реакции.
После денатурации запускается отжиг. В это время температуру смеси начинают снижать. Обычно она уменьшается на 4-5°С от исходной. Праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК. Их подбирают с определенным составом, который помогает выделить и отграничить исследуемый участок нуклеиновой кислоты. Эта стадия длится 0,5-2 минуты. Если температура подобрана неверно, праймеры могут не образовать связь с нужным участком молекулы или привязаться в неверном месте и образовать неверные продукты.
Последняя стадия – элонгация. Во время прохождения этого этапа подбирается оптимальная температура, которая подходит для используемой дезоксинуклеотидтрифосфаты. На каждую тысячу пар образующихся оснований нужно около 1 минуты. Этот этап длится 7-10 минут.
Этот цикл повторяется несколько раз.
Сколько по времени делается исследование?
Все зависит от поиска конкретного возбудителя, характера образца и количества искомых инфекций. Для получения ответа необходимо провести не менее 30 полных циклов амплификации, при длительности одного до 15 минут. Поэтому для получения результата нужно до 7 часов, а иногда и больше. Ответ выдается пациенту или отправляется лечащему врачу не позднее, чем через сутки после забора материала.
Результаты анализа и их расшифровка
Что показывает ПЦР-анализ, зависит от цели исследования. При качественном исследовании в бланке указывается наличие или отсутствие ДНК искомого возбудителя. Положительный результат обозначает присутствие инфекции, а отрицательный – отсутствие генетического материала.
Количественное ПЦР позволяет определить в режиме реального времени число молекул ДНК возбудителя. Это необходимо для диагностики условно-патогенных микроорганизмов, которые не требуют лечения в низких концентрациях. Такой подход применяют при диагностике уреа- и микоплазм.
Хламидии
Обследование на различные типы инфекции имеет свои особенности и показания. Анализ ПЦР на хламидии проводят чаще остальных. Это связано с широким распространением инфекции, бессимптомным течением у 60% женщин и большим количеством осложнений при хроническом инфекционном процессе. Обследоваться рекомендуется в следующих случаях:
- острые проявления вульвовагинита неясной этиологии;
- установление причины хронического воспаления половых органов;
- бесплодие;
- контроль эффективности лечения;
- скрининговое обследование.
Скрининг необходим у пациенток из групп риска, чтобы исключить бессимптомное носительство хламидий. Контроль излеченности проводится не ранее, чем через месяц после прохождения курса антибиотикотерапии.
Беременным предварительно проводится ИФА, чтобы определить наличие антител к хламидиям. Это обследование рекомендуется пройти в плане прегравидарной подготовки, чтобы при инфицировании провести лечение до наступления беременности и снизить риски осложнений как от самого возбудителя, так и от приема антибиотиков.
Уреаплазмы
Уреаплазмоз относится к инфекциям, вызванным условно-патогенной микрофлорой. Лечение не проводится при количестве менее, чем 10Х4 КОЕ. Но при наличии клинических проявлений хронического воспаления, которое плохо поддается лечению, беременным назначается антибиотикотерапия. Оптимально пройти исследование на этапе планирования беременности для уменьшения риска для плода. ПЦР на уреаплазмоз относится к обязательным исследованиям при бесплодии.
ВПЧ
Папилломавирусы приводят к появлению предраковых изменений шейки матки, но не все типы обладают таким потенциалом. Высоким онкогенным риском отличаются 16 и 18 типы, несколько ниже 33, 31, 51,52 и другие. А ВПЧ 6, 11, 42 типа становятся причиной остроконечных кондилом и редко обнаруживается в злокачественных опухолях. Анализ необходим при дисплазии шейки матки, входит в пакет скринингового обследования.
Герпес
Для исследования может использоваться не только кровь, но и соскоб со слизистой оболочки половых органов. Обследование проводят:
- при подготовке к беременности;
- диагностированной ВИЧ-инфекции;
- боли при мочеиспускании и отсутствии признаков бактериальной инфекции;
- для дифференциальной диагностики генитальных инфекций.
В крови вирус определяется на 4 сутки после инфицирования. Он относится к хроническим инфекциям, которые могут иметь длительный период ремиссии и находиться в дремлющем состоянии в спинальных ганглиях.
Кандиды
Урогенитальный кандидоз в 15% случаев протекает в хронической форме. Иногда во время появления зуда и жжения в мазке не обнаруживаются клетки гриба или его гифы. Обследование и последующая расшифровка ПЦР-мазка помогает установить грибковую инфекцию. Анализ может определить тип кандид для подбора противогрибкового препарата.
Трихомонады
Одноклеточный микроорганизм не всегда можно обнаружить в мазке, но при этом у женщины будут присутствовать признаки хронического воспаления, ощущение зуда и жжения половых органов. Исследование необходимо при поиске причин бесплодия, цистите, эндометрите неясной этиологии, длительном воспалении.
В гинекологии анализ ПЦР используется в составе комплексной диагностики ИППП. Это достоверный метод определения возбудителя по фрагментам ДНК. Производится забор венозной крови или отделяемого из влагалища. Длительность проведения анализа – сутки.
Часто требуется проверка иммунного ответа организма на инфекцию, по присутствию определенных антител можно установить давность инфицирования и этап течения болезни, что не позволяет сделать ПЦР.
Источник: